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            骨質疏松小鼠模型,助力疾病藥物研發
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            • 骨質疏松小鼠模型,助力疾病藥物研發

            骨質疏松小鼠模型,助力疾病藥物研發

            產品報價:詢價

            更新時間:2022/10/21 14:28:00

            地:北京

            牌:百奧動物

            號:骨質疏松

            廠商性質: 生產型,服務型,

            公司名稱: 百奧賽圖(北京)醫藥科技股份有限公司

            產品關鍵詞: 小鼠模型   RSPO1   SOST   骨質疏松   RANKL  

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            謝彭雪 : (13693217230) (010-56967680)

            (聯系我時,請說明是在來寶網上看到的,謝謝?。?/b>


             

            每年的10月20日是世界骨質疏松日。

            2022年世界骨質疏松日主題:

            鞏固一生,贏戰骨折。


            骨骼被稱作“人體的支架”,具有支撐、運動及保護人體重要臟器的作用。一旦發生骨質疏松,骨組織的柔韌度及硬度就會下降,很容易出現骨折等種種問題。


            隨著我國老齡化程度的不斷加深,骨質疏松癥(Osteoporosis,OP)已經成為患病率高、危害嚴重的慢性疾病,并在臨床上被視作老年群體的“沉默殺手”,嚴重影響老年人的身心健康和生活質量,給社會和家庭帶來沉重負擔,我國將其列為重點攻關的三大老年疾病之一。


            根據國內2018年發布的骨質疏松癥流行病學調查結果:國內骨質疏松癥患者發病人數超過1.5億,每年因骨質疏松導致骨折人群超過500萬。骨質疏松癥已成為我國中老年人群的重要健康問題,50歲以上人群骨質疏松癥患病率為19.2%,中老年女性骨質疏松問題尤甚,尤其是絕經后的女性,50歲以上女性患病率達32.1%,遠高于同齡男性的6%,而65歲以上女性骨質疏松癥患病率更是達到了51.6%。

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            骨質疏松的演變[1]


            現有骨質疏松癥藥物主要以鈣、維生素D 、雙膦酸鹽、降鈣素類及雌激素類等相對傳統的抗骨質疏松藥物為主,以RANKL抑制劑等為代表的治療方式還主要是在海外被醫患所接受。隨著這類產品在國內的臨床研發進度不斷加快,或可為我國骨質疏松患者帶來多元化的治療方案。


            針對相關疾病的研究和新藥開發的需求,BioMice百奧動物自主研發的B-hRANKL、 B-hSOST 、B-hRSPO1 小鼠,是優質的骨質疏松疾病模型,推進骨質疏松創新藥物研發進程。



            B-hRANKL mice


            靶點概述


            RANK屬于I型跨膜蛋白,是腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor,TNFR)超家族成員之一。RANK高度表達于許多細胞的表面如破骨細胞前體細胞、成熟破骨細胞等。RANKL是RANK的配體,主要由成骨細胞和活化的T淋巴細胞表達,有膜結合型和分泌型兩種類型。大多數促進破骨細胞形成和分化的因子均可誘導成骨細胞表達和分泌RANKL。RANKL與破骨細胞前體細胞表面的RANK結合,通過RANK的胞內信號通路誘導激活NF-κB,調控破骨細胞分化相關基因的表達,促進破骨細胞的分化成熟和活化。成骨細胞分泌的骨保護素(osteoprotegerin,OPG),可作為分泌型RANKL的受體,與RANK競爭性結合RANKL,從而抑制破骨細胞的生成和活化[2]。


            RANKL/RANK/OPG信號通路是調節破骨細胞分化、活化及功能的關鍵信號通路,也是抗骨質疏松藥物研發的重要靶點。Denosumab(地舒單抗)是可用于人體治療的活性強的RANKL抑制劑,也是上市的RANKL抑制劑。其以高親和力與RANKL結合,抑制RANKL與RANK的相互作用,抑制破骨細胞的生成與功能,從而減少骨吸收、增加骨量、改善骨強度[2]。

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            RANK/RANKL信號通路[2]


            另外,腫瘤微環境(TME)中腫瘤來源的RANKL也被認為能將浸潤的RANK + 的T細胞轉化為免疫調節性T細胞(Tregs)。通過Denosumab阻斷RANK/RANKL通路,從而暫時阻斷中樞耐受,可能會使抗腫瘤抗原的T細胞數量增加,減少Tregs,克服免疫抑制,發揮抗腫瘤的藥效[3]。


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            RANK/RANKL信號通路[3]



            靶點藥物研發進展


            當前在國內共有 4 款靶向 RANKL 的單特異性抗體創新在研,包括安進的進口藥地舒單抗以及 3 款國產新藥。

            安進的地舒單抗是一款已上市產品,早于 2019 年 5 月在國內獲批上市,用于骨巨細胞瘤不可手術切除或者手術切除可能導致嚴重功能障礙的成人和骨骼發育成熟的青少年患者。國內有 15 家企業在布局地舒單抗生物類似藥。


            表1. 部分在研藥物臨床進展

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            數據來源于科睿唯安



            基本信息


             

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            蛋白表達分析


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            通過流式細胞術對純合B-hRANKL 小鼠進行種屬特異性RANKL 表達分析。收集野生型C57BL/6和純合B-hRANKL 小鼠 (H/H)小鼠的脾細胞,結果顯示:小鼠 RANKL 在野生型小鼠中可檢查到。人RANKL在純合 B-hRANKL 小鼠中可到,但在 WT 小鼠中未到。


            脾臟白細胞亞群分析

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            用流式細胞術分析從雌性C57BL/6和B-hRANKL 小鼠(n=3,6周齡)中分離的脾細胞以評估白細胞亞群。A.具有代表性的FACS圖。B. FACS分析結果。純合B-hRANKL 小鼠的T細胞、B細胞、NK細胞、樹突狀細胞、粒細胞、單核細胞和巨噬細胞的百分比與C57BL/6小鼠相似,表明RANKL人源化不會改變這些細胞類型在脾臟的整體發育、分化或分布。


            脾臟T細胞亞群分析


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            利用流式細胞術分析純合B-hRANKL 小鼠和野生型小鼠脾臟中T細胞亞群(如圖),結果顯示純合B-hRANKL 小鼠與野生型小鼠中各T細胞亞群的百分比相似,表明人源化RANKL不會改變T細胞亞群在脾臟中的整體發育、分化或分布。


            淋巴結白細胞亞群的分析


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            利用流式細胞術分析純合B-hRANKL 小鼠和野生型小鼠淋巴結中白細胞亞群(如圖),結果顯示純合B-hRANKL 小鼠的白細胞亞群百分比與野生型小鼠相似,表明人源化RANKL不會改變白細胞亞群在淋巴結中的整體發育、分化或分布。


            淋巴結T細胞亞群分析


             

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            利用流式細胞術分析純合B-hRANKL 小鼠和野生型小鼠淋巴結中T細胞亞群(如圖),結果顯示純合B-hRANKL 小鼠與野生型小鼠中各T細胞亞群的百分比相似,表明人源化RANKL不會改變T細胞亞群在淋巴結中的整體發育、分化或分布。


             

            血液白細胞亞群分析


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            利用流式細胞術分析純合B-hRANKL 小鼠和野生型小鼠血液中白細胞亞群(如圖),結果顯示純合B-hRANKL 小鼠的白細胞亞群百分比與野生型小鼠相似,表明人源化RANKL不會改變白細胞亞群在血液中的整體發育、分化或分布。


            血液T細胞亞群分析


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            利用流式細胞術分析純合B-hRANKL 小鼠和野生型小鼠血液中T細胞亞群(如圖),結果顯示純合B-hRANKL 小鼠與野生型小鼠中各T細胞亞群的百分比相似,表明人源化RANKL不會改變T細胞亞群在血液中的整體發育、分化或分布。


             

            血漿中 mTRAcP-5b 濃度分析


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            B-hRANKL 小鼠的種屬特異性 TRAcP-5b 濃度檢查分析。收集野生型 C57BL/6 小鼠 (+/+) 和純合B-hRANKL 小鼠 (H/H) 的血漿,并用 TRAcP-5b ELISA 試劑盒通過 ELISA 進行檢查分析(n=3,7周齡或16周齡)。結果顯示:B-hRANKL 小鼠中 TRAcP-5b 的濃度與野生型小鼠相似。


             

            抗體結合試驗


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            B-hRANKL 小鼠的抗體結合分析。從野生型 C57BL/6 小鼠 (+/+) 和純合 B-hRANKL 小鼠 (H/H) 中收集CD4 + T細胞,并用FACS檢查分析。結果顯示:抗 hRANKL 抗體狄諾塞單抗(內部)能結合 B-hRANKL 小鼠的CD4 + T細胞,但不能結合野生型 C57BL/6 小鼠的細胞。


            抗人 RANKL 抗體在小鼠骨質疏松模型中的體內藥效


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            在B-hRANKL 小鼠骨質疏松癥模型中使用抗人 RANKL 抗體狄諾塞單抗(內部)可改善骨質疏松癥的幾個關鍵指標。首先將小鼠隨機分組,并接受卵巢切除或假手術處理。在術后4周將去卵巢小鼠隨機分為3組(OVX、Denosumab和PTH1-34)(n=6),經過4周治療后,取材。治療前后留取血清3次,分析1型膠原 C 末端肽 (CTX-1) 和骨鈣素 (OC)。血清采集時間點見圖A。采集脛骨近端,通過μCT分析骨密度 (BMD)。A-B:血清骨吸收標志物 CTX-1 和血清骨形成標志物 OC 的濃度。C:各組脛骨近端的代表性micro-CT圖像。D:脛骨近端骨密度(BMD)變化。

            結果顯示,與假手術組相比,OVX組骨吸收標志物 CTX-1 濃度顯著升高,而骨形成標志物 OC 濃度和脛骨近端 BMD 變化顯著降低,表明B-hRANKL 小鼠骨質疏松模型造模成功。接受抗人 RANKL 抗體或 PTH 治療組,與未接受治療的 OVX 模型組相比,CTX-1的濃度顯著降低,而 OC 的濃度和 BDM 的變化百分比顯著增加。這些結果表明抗人 RANKL 抗體可治療 B-hRANK 小鼠的骨質疏松。B-hRANKL 小鼠為體內評價抗人 RANKL 抗體的藥效提供了有力的臨床前小鼠模型。


            B-hSOST mice


            靶點概述


            SOST, 又稱sclerostin,是由骨細胞分泌的一種糖蛋白,對骨的形成起負性調節作用。成骨細胞主要維持骨的形成,經典的Wnt信號通路對成骨細胞的增殖起到了重要作用。SOST與LRP5及LRP6輔助性受體結合, 抑制卷曲蛋白及Wnt信號與上述受體結合, 從而降低骨的形成。

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            SOST抗體信號通路[4]


            使用anti-SOST中和SOST后,Wnt能夠與LPR5/6結合,導致GSK-3β降解以及β-catenin的積累和入核,從而上調與成骨相關疾病的表達。


             

            SOST靶點藥物研發進展


            針對SOST,安進的AMG-785(Romosozumab)已經在2019年獲批上市,這也是既抑制骨組織再吸收并加快骨組織形成的骨質疏松藥物;禮來及國內恒瑞的藥物開發進入一期臨床,賽諾菲和諾華的項目還在臨床前階段。


            表2. 部分在研藥物臨床進展

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            數據來源于科睿唯安

             

             



            基本信息


             

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            mRNA表達檢查


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            RT-PCR檢查野生型 C57BL/6 小鼠 (+/+) 和純和B-hSOST 小鼠 (H/H) 中mRNA表達,在野生型 C57BL/6 小鼠 (+/+) 心臟和睪丸組織中檢查到Sost mRNA表達,在B-hSOST 小鼠 (H/H) 心臟和睪丸組織中檢查到人SOST mRNA表達。


             

            蛋白表達檢查


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            Western blot檢查野生型 C57BL/6 小鼠 (+/+) 和B-hSOST 小鼠 (H/H)中SOST蛋白表達,使用人鼠交叉抗體,在野生型 C57BL/6 小鼠 (+/+)和B-hSOST 小鼠 (H/H)心臟組織中均檢查到SOST蛋白表達。


             

            B-hRSPO1 mice


             

            靶點概述

            Rspo1(R-spondin 1),又稱CRISTIN3,該基因編碼一種分泌蛋白,該蛋白由兩個富含半胱氨酸殘基的類呋喃結構域和一個I型血小板反應蛋白(thrombospondin)結構域組織。Rspo1是經典Wnt信號通路的激活劑,與LGR 4-6(leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptors)結合,并能夠激活Wnt信號通路。在骨中,Rspo1與Wnt3a協和增強經典Wnt信號通路以及成骨標志物水平,如堿性酶活性和骨鈣素表達。還能夠通過調節成骨細胞的OPG表達來抑制破骨細胞生成。因此,Rspo1被認為是治療病理和衰老相關骨丟失、炎性骨損傷的潛在治療靶點。

            人纖維化肝臟組織中Rspo1過度表達,此外,Rspo1激活能夠促進卵巢腫瘤的發生發展,表明Rspo1可能也是纖維化及卵巢癌腫瘤的治療靶點。

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            Rspo1介導的Wnt信號通路激活[5]


            當Rspo1缺陷時,Frizzled被Znrf3/Rnf43泛素化后被受體復合物內吞,Wnt信號的激活被抑制。Rspo1與其受體Lgr4/5/6結合,該復合物與Znrf3/Rnf43結合,并抑制Frizzled泛素化的發生,從而激活Wnt下游信號。


             

            靶點藥物研發進展


            對于RSPO1在腫瘤中作用的研究尚處于起步階段,大部分研究還停留在腫瘤組織、細胞及動物實驗上,對其在分子水平上的認識仍十分有限。鑒于Wnt信號可以作為藥物開發的目標,繼續拓展體內外實驗、探討RSPO1如何調控經典Wnt信號活性以及和其他調控因子的聯系,有助于進一步探索相關腫瘤的發生、發展機制以及提供腫瘤治療過程中更豐富的靶點選擇。


             

            基本信息


             

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            mRNA表達檢查


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            RT-PCR檢查野生型 C57BL/6 小鼠 (+/+)和純合B-hRSPO1 小鼠 (H/H)中RSPO1 mRNA表達,在野生型 C57BL/6 小鼠 (+/+)腎臟組織中檢查到Rspo1 mRNA表達,在純合B-hRSPO1小鼠 (H/H)腎臟組織中檢查到人RSPO1 mRNA表達。


            蛋白表達檢查


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            Western blot檢查野生型 C57BL/6 小鼠 (+/+)和純合B-hRSPO1 小鼠 (H/H)中RSPO1蛋白表達,使用人鼠交叉抗體,在野生型 C57BL/6 小鼠 (+/+)和純合B-hRSPO1小鼠 (H/H)肝臟組織中均檢查到RSPO1蛋白表達。



            骨質疏松是可防可治的,防重于治。因此從年輕時就要加強鍛煉、常曬太陽、適時補充維生素D及鈣劑,以促進骨生長,保持人體“骨礦銀行”的峰值儲備,從而延緩骨質疏松癥的發生。



            參考文獻

            [1]中華醫學會骨質疏松和骨礦鹽疾病分會.原發性骨質疏松癥 診療指南( 2017) [J]. 中華骨質疏松和骨礦鹽疾病雜志, 2017,10( 5) : 413-444.

            [2-3]Ming, J., Cronin, S.J.F. & Penninger, J.M. Targeting the RANKL/RANK/OPG Axis for Cancer Therapy. Front Oncol 10, 1283 (2020).

            [4]Modified from Rachner, T. D., Khosla, S. & Hofbauer, L. C. Osteoporosis: now and the future. Lancet (London, England) 377, 1276-1287, doi:10.1016/s0140-6736(10)62349-5 (2011).

            [5]Nagano, K. R-spondin signaling as a pivotal regulator of tissue development and homeostasis. The Japanese dental science review 55, 80-87, doi:10.1016/j.jdsr.2019.03.001 (2019).


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